Resumen - tesis-erika
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas
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Resumen
El
estudio de las interacciones proteína-ligando son importantes para comprender
los procesos a nivel molecular, celular y por los fines aplicados que de ellos
se desprenden.
Para
este trabajo nuestro modelo de estudio fue la proteína calmodulina (CaM), que
es una proteína ubicua, altamente conservada y considerada la principal
proteína señalizadora de calcio en las células eucariotas. Modula cerca de 300
proteínas relacionadas con diversos procesos fisiológicos y patológicos. Es
considerada un blanco molecular al que se han dirigido fármacos antipsicóticos,
anticancerígenos y relajantes musculares pero que presentan efectos secundarios
debido a la baja selectividad del complejo proteico a inhibir.
La
cinasa de la cadena ligera de miosina de músculo esquelético (skMLCK) y la
sintasa del óxido nítrico neuronal (nNOS) son dos principales proteínas que
regula la CaM y que participan en la contracción de músculo esquelético y la
comunicación neuronal, respectivamente. Patológicamente, la skMLCK está
asociada con distrofias miotónicas y, por su parte, la nNOS con enfermedades
neurodegenerativas como Alzheimer y Parkinson. Por su importancia
farmacológica, se estudiarán las interacciones de estas proteínas con la CaM.
El
presente trabajo describe las interacciones moleculares de la CaM en presencia
de diferentes ligandos: CaM-Ca2+, CaM-péptido a diferentes
concentraciones de Ca2+, CaM-proteína, CaM-proteína-fármaco, CaM-proteína-fármaco-péptido,
CaM-proteína-péptido diseñado, con el objetivo de obtener péptidos para dos
complejos proteico específicos. El estudio teórico-experimental de las
interacciones CaM-ligando se realizó utilizando herramientas de modelaje molecular
y el biosensor hCaM-M124C-mBBr, respectivamente.
La
parte teórica conllevo a la obtención de los modelos estructurales de los
complejos CaM-péptido, CaM-proteína, CaM-proteína-péptido diseñado por modelaje
ab initio y homología.
Posteriormente, se realizaron dinámicas moleculares de los complejos, simulando
el comportamiento de las moléculas involucradas en el sistema. El análisis de
estas nos proporcionó información de la interacción estudiada (parámetros
termodinámicos teóricos, RMSD, RMSF, residuos participantes).
Los péptidos skMLCK, nNOS, Cav1.1 y Calspermin
fueron utilizados como péptidos modelo para los ensayos de unión CaM-péptido.
Se determinaron cinco constantes de disociación (Kd) en función de las diferentes concentraciones de Ca2+
para cada péptido. Las afinidades de los péptidos por la CaM se encontraron en
el orden de concentración nanomolar. Los péptidos skMLCK, nNOS y Calspermin
muestran que a mayor concentración de Ca2+ en la titulación su
afinidad por la CaM se incrementa, mientras la unión de Cav1.1 no presenta
dependencia de la concentración de Ca2+.
En los ensayos de competencia
CaM-ligandos, se observan desplazamientos de la interacción de los ligandos
menos afines (proteínas, moléculas bioactivas) por los más afines (péptidos)
con el biosensor de CaM, como se había de esperar.
Se determinó una estrategia
para el diseño de péptidos específicos para los complejos CaM-skMLCK y
CaM-nNOS, considerando la ubicuidad y promiscuidad de la CaM y, asegurar así,
una mayor selectividad. Se diseñaron dos péptidos denominados MLCK-A y NOS-A,
para la interacción con los complejos CaM-skMLCK y CaM-nNOS, respectivamente.
Los péptidos diseñados no se
unen a la CaM. Sin embargo, sí modifican estructuralmente a los complejos
proteicos CaM-skMLCK y CaM-nNOS. Lo anterior nos indica que los péptidos
diseñados podrían inhibir de manera específica los complejos designados, siendo
esto una base para el desarrollo potencial de biofármacos en el tratamiento de
patologías relacionadas con los complejos proteicos estudiados.